聚碳酸酯膜作為載體的一大應用

　　聚碳酸酯膜性質和優點

　　與固形物顏色不接近，背景反差大，利于用顯微鏡觀察。

　　可靠的表面吸附，方便樣品分析、縮短分析時間。

　　有*透明的膜，吸附很低，不吸潮。

　　皮重低，沒有顆粒脫落物，超凈過濾，生物學惰性。

　　聚碳酸酯膜一個比較典型的應用就是作為載體，本文介紹的是采用了微孔聚碳酸酯膜作為EC和SMC共培養的載體，該模型可以模仿體內EC和SMC的組織結構關系，在此基礎上，利用倒置顯微鏡和透射電鏡觀察了兩種細胞的生長情況和細胞間縫隙連接情況，為下一步研究兩者間的電生理活動提供了保障。

　　注意：EC，即endothelial cell 血管內皮細胞。SMC，即smooth muscle cell 和平滑肌細胞

　　一、材料和方法

　　(1)材料。牛主動脈取自健康屠宰小牛;SD大鼠仔鼠(第四軍醫大學實驗動物中心);1640培養基(Gibco);加強小牛血清(Hyclone);聚碳酸酯膜(10mm×15mm，厚12μm，孔徑5μm，孔密度2800 mm-2 ，Millipore公司);2g L-1 明膠(Gibco).

　　(2)方法

　　1.牛主動脈EC(BAEC)和仔鼠SMC的分離和鑒定 按我們已建立的方法培養并鑒定牛主動脈EC和仔鼠胸主動脈SMC[7] ，利用2～5代細胞進行實驗。

　　2.EC和SMC的共培養 ①聚碳酸酯膜的準備:取聚碳酸酯膜0.15MPa20min高壓消毒后備用，用前用明膠包被，培養箱內孵育3h，PBS浸洗后接種細胞;②共培養:按密度1×104 cm-2 將內皮細胞接種于聚碳酸酯膜的一側，常規培養24h后翻轉聚碳酸酯膜，將平滑肌細胞接種于膜的另一側，24h后換液，以后每日換液1次，常規倒置顯微鏡觀察，取接種后1，3和4d共培養標本進行透射電鏡觀察.

　　3.透射電鏡(TEM)標本的準備[8，9] 取出兩側長有細胞的聚碳酸酯膜，用預熱的PBS漂洗，然后在含25g L-1 戊二醛，0.1mol L-1 二甲胂酸鈉溶液(pH7)里固定1h，20℃，再用10g L-1 四氧化鋨固定1h，20℃，用1g L-1 的鞣酸染色，1h，20℃，來加強對比，然后用梯度乙醇逐級脫水，之后把標本浸于乙醇-EPON(1 1)中，1h，20℃，zui后用EPON-環氧樹脂包埋.用刀片將包埋塊切成小塊，垂直細胞層作超薄切片，用150目碳包被的銅網收集，然后用100g L-1 醋酸雙氧鈾和4g L-1 檸檬酸鉛染色.

　　二、結果

　　1.SMC和EC在聚碳酸酯膜上生長情況，細胞在接種2h后開始在膜上貼附延伸，接種1d后EC逐漸融合，呈單層生長，細胞呈多邊形.SMC在接種1d后細胞之間開始融合，對數生長，至第2日可見SMC融合，EC外形呈明顯伸長改變，細胞邊界清楚。第3日SMC開始出現細胞分層生長，EC生長減慢.至第4日時兩種細胞出現衰退現象。

　　2.SMC和EC在聚碳酸酯膜上同類和異類細胞間縫隙連接形成的超微結構 透射電鏡結果顯示，共培養1d后的EC和SMC在膜上呈單層生長狀態，可觀察到EC之間的縫隙連接(Fig1)，聚碳酸酯膜孔內可見細胞突起(Fig2)，EC和SMC通過微孔之間形成縫隙連接(Fig3)，在縫隙連接形成處可見兩個細胞的質膜互相靠攏，其間有2～3nm的縫隙，其中可見電子密度較高的顆粒組成的虛線狀結構。

　　共培養后第3日時，可以看到EC穿過微孔生長到膜的另一側(Fig4)，到對側與SMC形成縫隙連接，且縫隙連接形成的多少與共培養的時間有關，經過電鏡觀察到在接種SMC1d后，穿過微孔的EC有30%～40%可以與對側的SMC形成縫隙連接，而在第3日就可以達到70%～80%。還可以觀察到SMC呈現多層生長現象(Fig5)，至第4日時SMC明顯發生退變，底層SMC開始分解(Fig6)。

　　聚碳酸酯膜還有其他的應用，更多詳情咨詢!